無傷のヒトサイトメガロウイルスビリオンの空間分解タンパク質マップ

Nature Microbiology volume 8、pages 1732–1747 (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

ヘルペスウイルスは、そのサイズ、脆弱性、および部分的に非晶質の性質を持つ複雑な多層プロテオームのため、構造的に特徴付けることが困難な大きなエンベロープ粒子を組み立てます。ここで我々は、架橋質量分析と定量的プロテオミクスを使用して、無傷のヒトサイトメガロウイルスビリオンの空間的に分解されたインタラクトームマップを導き出しました。これにより、32 種類のウイルスタンパク質を、空間的に分解された 4 つのビリオン層に新規に割り当てることが可能になり、各層は主要なウイルス足場タンパク質によって組織化されました。ウイルスタンパク質 UL32 は、N 末端から C 末端へ放射状の配向ですべての層と結合し、ヌクレオカプシドとウイルスエンベロープを架橋します。 82 種類の宿主タンパク質が層特異的に取り込まれ、そのうち 39 種類が選択的に動員されることが観察されました。我々は、UL32がPP-1ホスファターゼの動員によってどのように14-3-3タンパク質への結合に拮抗するかを明らかにした。このメカニズムは効果的なウイルス生合成を保証し、UL32-14-3-3 相互作用の混乱的な役割を示唆しています。最後に、これらのデータを粗粒度モデルに統合して、ヘルペスビリオン内のウイルスと宿主タンパク質の相互作用のネイティブ構成についての全体的な洞察を提供しました。

ビリオンと呼ばれる感染性粒子の構造化された集合体は、細胞や生物間のウイルス感染の基礎となります。ビリオンには、カプシドタンパク質の殻に囲まれたウイルス核酸ゲノムが含まれています。同時パッケージ化された多くのタンパク質は、感染プロセスとウイルス遺伝子発現の開始を促進します。二本鎖 DNA ウイルスのファミリーであるヘルペスウイルスは、感染時に宿主細胞に送達される多くの異なるタンパク質を収容する、特に大きくて複雑な粒子を組み立てます。

ヘルペスビリオンが多数のタンパク質を取り込む能力は、その典型的な多層構造によって可能になります1。外側の脂質エンベロープには、宿主細胞の受容体結合と膜融合に必要なさまざまなウイルス糖タンパク質が含まれています2。エンベロープと中央の正二十面体ヌクレオカプシドの間の空間は、タンパク質性マトリックスである外皮で満たされています。個々の外皮タンパク質は、生化学 3 および顕微鏡データ 4,5 に基づいて、異なる内層および外層に割り当てられていますが、外皮タンパク質の構成の詳細はわかっていません。ヘルペスウイルス粒子には多数の宿主タンパク質も組み込まれていますが、これらのイベントのうち機能的または機構的に特徴付けられているものはほとんどありません 6,7。

最近のヘルペスビリオンの極低温電子顕微鏡 (cryoEM) 研究により、ヌクレオカプシド 8,9、ポータル 10,11 およびいくつかの糖タンパク質複合体 2,12,13 の下部構造が明らかになりました。さらに、以前の研究では、ヘルペスビリオンの全体的なタンパク質組成についての洞察が得られただけで、46 ～ 82 個のウイルスタンパク質が同定されていました 14、15、16、17、18。しかし、ビリオン内のウイルスと宿主タンパク質の空間的調整と相互作用の体系的な特徴付けは不足しています。

今回我々は、架橋質量分析法（XL-MS）を用いて、最大のヒトヘルペスウイルスであるヒトサイトメガロウイルス（HCMV）の無傷の細胞外ビリオンに含まれる32のウイルスタンパク質と82の宿主タンパク質のビリオン全体の近接マップを構築した。このデータにより、宿主タンパク質とウイルスタンパク質、およびそれらのタンパク質間相互作用 (PPI) をビリオン層に新たに割り当てることが可能になり、外皮下層の組織についての洞察が得られます。私たちは、ウイルスタンパク質 UL32 (pp150 としても知られる) が主要な足場として機能し、粒子全体で PPI に関与し、14-3-3 タンパク質やプロテインホスファターゼ 1 (PP-1) などの宿主タンパク質の動員を媒介することを発見しました。。 PP-1 は UL32 への 14-3-3 の結合に拮抗し、ウイルス遺伝子発現の効率的な開始とウイルス子孫の産生に必要です。したがって、天然のヘルペスビリオン内のプロテオーム構成を図示することにより、重要な PPI の構造的および機能的理解の基礎が提供されます。

0.75 in n = 2 biological replicates) in virions (bottom bar). d,e, Purified virions from recombinant mutant viruses harbouring alanine substitutions in the designated motifs were assessed for protein levels by immunoblotting. Representative experiments of n = 2 biological replicates are shown./p>91% of the protein copies inside a virus particle./p>

10 copies) be identified in both replicates. When a crosslink involved a lower-abundance protein (that is, <10 copies), we required that the crosslink be identified in only one of the replicates. The rationale is that this balances crosslink confidence for highly abundant proteins with sensitivity for low-abundance proteins. Second, PPIs were only reported when there were two unique crosslinks identified, giving a higher-confidence set of PPIs. To retain only host proteins incorporated into the particle, host proteins that did not directly link to viral proteins were removed. The filtered set of crosslinks is available in Supplementary Table 2. The list of the corresponding PPIs together with evidence from existing data is available in Supplementary Table 3. The XL-based PPI network was generated on the basis of interprotein crosslinks from Supplementary Table 2 and visualized using edge-weighted spring-embedded layout70 in Cytoscape v.3.7.2. Edge weighting was based on the number of identified interlinks between protein pairs. Additional crosslink networks between selected proteins were visualized using xiNET71./p>

0.75 were considered (from the Phospho (STY).txt table). The positions of individual phosphosites as identified from this experiment were used to map phosphosites on the UL32 amino acid sequence (Fig. 4c). Phosphosite SILAC ratios were also corrected for the protein-level SILAC ratios (from proteinGroups.txt) as quantified from an analysis of the whole-virion proteome without IMAC enrichment. Phosphosites were excluded when the corresponding phosphopeptide contained residues mutated in the SILK/RVxF motifs of UL32. Then, protein-level corrected phosphosite ratios were averaged (quantification in both replicates required)./p>0.6 were considered./p>

220 nm). These correspond to the median of diameters from the purified sample ± two times the standard deviation. The fraction of particles with diameters that fall below 160 nm, exceed 220 nm or fall in between are indicated for the non-cross-linked (d) or cross-linked (e) sample types. Purification results in more homogeneous particle diameters, enriching virions in the expected size range. Thus, our protocol captures the native configuration of the particles at relatively high sample purity. At least 367 particles were counted per condition./p>